與經(jīng)典的液相色譜法相比，高效液相色譜法具有下列主要優(yōu)點(diǎn)：①應(yīng)用了顆粒極細(xì)(一般為10μm以下)、規(guī)則均勻的固定相，傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高;②采用高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，一般試樣的分析需數(shù)分鐘，復(fù)雜試樣分析在數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成;③廣泛使用了高靈敏檢測器，大大提高了靈敏度。目前，已經(jīng)發(fā)展了多種不同的固定相，有多種不同的分離模式，使高效液相色譜法的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。下面介紹高效液相色譜法的有關(guān)知識(shí)，新的方法和技術(shù)以及在藥物分析中的應(yīng)用。

　　一、分類

　　高效液相色譜法按分離機(jī)理的不同可分為以下幾類：

　　(一)吸附色譜法(adsorptionchromatography)以吸附劑為固定相的色譜方法稱為吸附色譜法。使用最多的吸附色譜固定相是硅膠，流動(dòng)相一般使用一種或多種有機(jī)溶劑的混合溶劑。在吸附色譜中，不同的組分因和固定相吸附力的不同而被分離。組分的極性越大、固定相的吸附力越強(qiáng)，則保留時(shí)間越長。流動(dòng)相的極性越大，洗脫力越強(qiáng)，則組分的保留時(shí)間越短。

　　(二)液-液分配色譜法(liquid-liquidchromatography)液-液分配色譜的固定相和流動(dòng)相是互不相溶的兩種溶劑，分離時(shí)，組分溶入兩相，不同的組分因分配系數(shù)(K)的不同而被分離。目前廣泛使用的化學(xué)鍵合固定相是將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上而制成的，使用化學(xué)鍵合固定相的色譜方法(簡稱鍵合相色譜法)可以用分配色譜的原理加以解釋。鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位，是應(yīng)用最廣的色譜法。按照固定相和流動(dòng)相極性的不同，分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類。

　　1.正相色譜法(normalphasechromatography)固定相極性大于流動(dòng)相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜法，簡稱為正相色譜法。氰基鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠等極性的化學(xué)鍵合固定相是正相色譜常用的固定相，正相色譜的流動(dòng)相一般為極性較小的有機(jī)溶劑。在正相色譜中，極性小的組分由于K值較小先流出，極性較大的組分后流出。正相色譜法用于溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)的分離。

　　2.反相色譜法(reversedphasechromatography)流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法，簡稱為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相，最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠，還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動(dòng)相常用水與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因K值較小先流出色譜柱，極性較小的組分后流出。流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例增加，流動(dòng)相極性減小，洗脫力增強(qiáng)。反相色譜法是目前應(yīng)用最廣的高效液相色譜法。

　　(三)離子交換色譜法(ionexchangechromatography)離子對(duì)交換色譜法是以離子交換劑為固定相的色譜方法，組分因和離子交換劑親和力的不同而被分離。柱填料含有極性可離子化的基團(tuán)，如羧酸、磺酸或季銨離子，在合適的PH值下，這些基團(tuán)將解離，吸引相反電荷的物質(zhì)。由于離子型物質(zhì)能與柱填料反應(yīng)，所以可被分離。

　　樣品中不同的組分因離子交換平衡常數(shù)的不同而分離。離子交換色譜的流動(dòng)相一般為一定PH值的緩沖溶液，有時(shí)也加入少量的有機(jī)溶劑，如乙醇、四氫呋喃、乙腈等，以增大組分在流動(dòng)相中的溶解度。流動(dòng)相的PH值影響離子交換劑的交換容量。對(duì)弱酸或弱堿性的被分離組分，流動(dòng)相的PH值還會(huì)影響其電離狀況，流動(dòng)相的PH值必須使待分離組分處于離解狀態(tài)，才能被分離。離子交換色譜法用于分離在測定條件下呈離解狀態(tài)的組分，如具有酸性或堿性的化合物，反相離子對(duì)色譜法在藥物分析中的應(yīng)用非常廣泛，例如生物堿、磺胺類藥物、某些抗生素及維生素等的分析均可采用此方法。

　　(四)空間排斥色譜法(stericexclusionchromatography)空間排斥色譜也稱為凝膠色譜。其固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質(zhì)，即凝膠。被分離組分因分子空間尺寸大小的不同而被分離。當(dāng)組分被流動(dòng)相攜帶進(jìn)入色譜柱時(shí)，體積大的分子不能進(jìn)入固定相表面的孔穴中，而隨流動(dòng)相直接通過色譜柱，保留時(shí)間最短。體積較小的分子可以進(jìn)入孔穴內(nèi)，在色譜柱中所走的途徑較長，保留時(shí)間也較長。分子的尺寸越小，可進(jìn)入的孔穴越多，所走的路徑越長，保留時(shí)間也越長。因此，凝膠色譜中，在一定范圍內(nèi)，體積不同的分子保留時(shí)間不同，從而達(dá)到分離的目的。凝膠色譜法主要用來分離高分子化合物，如蛋白質(zhì)、多糖等。由于分子量和分子體積有關(guān)，凝膠色譜還可以用來測定組分的分子量。

　　(五)親和色譜法(lighperformanceaffinitychromatography)親和色譜法是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從生物樣品中分離和分析一些特殊物質(zhì)的色譜方法。生物分子之間的專一作用包括抗原與抗體，酶與抑制劑，激素和藥物與細(xì)胞受體，維生素與結(jié)合蛋白，基因與核酸之間的特異親和作用等。親和色譜的固定相是將配基連接于適宜的載體上而制成的，利用樣品中各種物質(zhì)與配基親和力的不同而達(dá)到分離。當(dāng)樣品溶液通過色譜柱時(shí)，待分離物質(zhì)X與配基L形成X-L復(fù)合物，而被結(jié)合在固定相上，其他物質(zhì)由于與配基無親和力而直接流出色譜柱，用適宜的流動(dòng)相將結(jié)合的待分離物質(zhì)洗脫，如采用一定濃度的醋酸或氨溶液為流動(dòng)相，減小待分離物質(zhì)與配基的親和力，使復(fù)合物離解，從而將被純化的物質(zhì)洗脫下來。

　　HPAC可用于生物活性物質(zhì)的分離、純化和測定，還可以用來研究生物體內(nèi)分子間的相互作用及其機(jī)理等。

　　(六)手性色譜法(chiralchromatography)不少有機(jī)藥物的結(jié)構(gòu)中有不對(duì)稱碳原子，又稱手性碳原子，有手性碳原子的藥物具有旋;光性。立體構(gòu)型不同的一對(duì)對(duì)映體，其藥效、毒副作用往往不相同。例如抗高血壓藥物а-甲基多巴是S-(-)體;又如氯霉素(含有二個(gè)手性碳原子)，只有D-(-)異構(gòu)體有效.而L-()異構(gòu)體完全無效。沙利度胺(反應(yīng)停)的兩個(gè)對(duì)映體對(duì)小鼠鎮(zhèn)靜作用的效價(jià)相近，但只有左旋異構(gòu)體才有胚胎毒及致畸作用。因此，對(duì)映體的分離，在藥物的制備和質(zhì)量控制方面，都具有重要的意義。對(duì)映體在普通條件下的理化性質(zhì)是相同的，因此分離對(duì)映體需要在手性條件下進(jìn)行。分離對(duì)映體的色譜方法稱為手性色譜法。手性色譜法分為間接法和直接法兩種。間接法是將對(duì)映體與一定的手性衍生化試劑反應(yīng)，使其由對(duì)映體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映體，再利用他們理化性質(zhì)的差異，用一般的色譜條件進(jìn)行分離。直接法不需作衍生化反應(yīng)，直接利用手性色譜柱或手性流動(dòng)相進(jìn)行分離，應(yīng)用較多，以下主要介紹直接法。

　　1.手性固定相(chiralstationaryPhase，CSP)手性藥物拆分前的對(duì)映體通常以鏡象存在，即以外消旋體形式存在。用常規(guī)分析和制備方法不能將其拆分，需引入不對(duì)稱(即手性)環(huán)境，使欲拆分的對(duì)映體(樣品)、手性作用物(比如固定相)和手性源形成一個(gè)非對(duì)映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。為了形成這樣一種分子絡(luò)合物，分子之間要有一種同時(shí)相互存在的作用力，以保持分子的空間定位。Dalgliesh認(rèn)為至少要有三個(gè)作用力，其中一個(gè)要有立體選擇性，可以是吸引的，也可以是排斥的。這就是“三點(diǎn)相互作用”理論。如果對(duì)映體中某一種對(duì)映體正好與此三個(gè)作用點(diǎn)配對(duì)，相互作用較強(qiáng)，保留時(shí)間就長。而另一種對(duì)映體因空間構(gòu)型不同，不能完全配對(duì)，作用相對(duì)較弱，保留時(shí)間就短，從而可以得到分離。固定相的作用可以是氫鍵、偶極一偶極作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用等。

　　l.1常用的手性固定相有以下幾種。

　　(1)Pirkle型手性固定相

　　Pickle型手性固定相是由美國學(xué)者Pirkle主持研制的，主要有π-堿性(斥電子基)手性固定相和π-酸性(吸電子基)手性固定相。在分離的過程中，化合物與固定相之間發(fā)生π-π電荷轉(zhuǎn)移相互作用，此類固定相為電荷轉(zhuǎn)移型手性固定相。

　　(2)蛋白質(zhì)類手性因定相

　　蛋白質(zhì)是由手性亞基團(tuán)氨基酸組成的大分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)類手性固定相是將蛋白質(zhì)通過氨基酸鍵合到硅膠上而制成的。常用的蛋白質(zhì)類手性固定相有牛血清蛋白(RSA)和人血a1-酸性糖蛋白(AGP)的手性固定相，商品有ChiralAGP，Resolvosil，EnantioPac等。

　　蛋白質(zhì)類手性固定相應(yīng)用范圍較廣，效果良好，但該類固定相的譜柱容量較小。常用洗脫系統(tǒng)是磷酸鹽緩沖溶液(PH4～7)，離子強(qiáng)度為0～500mmol，有機(jī)改性劑不得超過5%。用蛋白質(zhì)類手性固定相拆分酸性和堿性傾倒物對(duì)映體時(shí)，流動(dòng)相內(nèi)可分別加少量離子對(duì)試劑，如N，N-二甲基辛胺，叔丁胺氫溴酸鹽和辛酸，以獲得理想的分離結(jié)果。

　　(3)多糖類手性固定相

　　多糖類手性固定相中應(yīng)用最多的是環(huán)糊精。環(huán)糊精(cyclodextrin,CD)是一類環(huán)形寡聚糖，為手性高分子物質(zhì)，。根據(jù)分子中葡萄糖單元的個(gè)數(shù)不同，環(huán)糊精可分為α、β、γ三類，他們分別由6、7、8個(gè)D-吡喃葡萄糖組成，將CD分別通過硅烷鏈連接在硅膠表面就構(gòu)成環(huán)糊精手性固定相。環(huán)糊精分子成錐桶狀，內(nèi)腔的直徑由組成環(huán)糊精的葡萄糖個(gè)數(shù)決定，如常用的β-環(huán)糊精由7個(gè)葡萄糖分子組成，內(nèi)腔直徑為0.8nm。

　　用環(huán)糊精手性固定相進(jìn)行分離時(shí)，首先要求被拆分的組分進(jìn)人洞穴，形成包合物，保留時(shí)間以組分能否進(jìn)人洞穴及其緊密的程度而定，環(huán)糊精環(huán)上還有多個(gè)手性中心，能選擇性地;與對(duì)映體作用，從而導(dǎo)致對(duì)映異構(gòu)體的保留不同而被分離。如用β-環(huán)糊精手性固定相已經(jīng)成功地分離了二茂鐵等金屬有機(jī)絡(luò)合物、氨基酸以及生物堿等。

　　除環(huán)糊精外，多糖類的手性固定相還可以用纖維素、直鏈淀粉作成，如纖維素三醋酸醋手性固定相、纖維素三苯甲酸醋手性固定相和纖維素氨基甲酸酯手性固定相等。

　　(4)冠醚(Grownether)類手性固定相

　　冠醚與環(huán)糊精類似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚鍵的環(huán)狀化合物，呈王冠狀結(jié)構(gòu)，外層是親脂性的乙撐基，環(huán)的內(nèi)層是富電子的雜原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙煒骨架或硅膠上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分離對(duì)映體時(shí)，不同對(duì)映異構(gòu)體因與冠醚環(huán)腔形成的主客體絡(luò)合物的穩(wěn)定性不同而被分離。在冠醚上引人雙萘基，雙萘基可以形成“手性墻”，增加固定相的立體選擇性。能質(zhì)子化的氨基化合物，特別是氨基酸對(duì)映體在冠醚手性固定相上可以得到很好的分離。

　　除以上手性固定相外，還有模擬酶手性固定相、配位交換手性固定相等。

　　2.手性流動(dòng)相(chiralmobilephase，CMP)拆分法

　　手性流動(dòng)相拆分法是將手性試劑添加到流動(dòng)相中，利用手性試劑與對(duì)映異構(gòu)體結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù)不同或結(jié)合物在固定相上分配的差異進(jìn)行分離。近年來，手性流動(dòng)相拆分法已廣泛應(yīng)用于藥物對(duì)映體的拆分。此法的最大優(yōu)勢在于：可采用普通的非手性固定相，不需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更換，同時(shí)添加物的可變范圍較寬，穩(wěn)定性好，且價(jià)格便宜。

　　(1)配體交換型手性添加劑

　　配體交換型手性添加劑由手性配基和含二價(jià)金屬離子的鹽組成。手性配基多為具有光學(xué)活性的氨基酸及其衍生物，他們和二價(jià)金屬離子螯合，分布于流動(dòng)相中，遇到待分離的對(duì)映異構(gòu)體時(shí)，即形成配合物，再在流動(dòng)相和固定相之間分配而實(shí)現(xiàn)分離。分離的機(jī)理一般認(rèn)為是配基和金屬離子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成動(dòng)態(tài)的手性固定相而發(fā)揮作用。也可以看成是手性配基、金屬離子和對(duì)映異構(gòu)體形成的配合物穩(wěn)定常數(shù)不同而產(chǎn)生分離。采用5μm粒徑的C18固定相，阿司帕坦作為CMPA，與硫酸銅絡(luò)合，測定高血溶素患者尿中D-和L-2-哌啶酸的濃度。

　　(2)環(huán)糊精添加劑

　　環(huán)糊精在水中有一定的溶解度，用環(huán)糊精作為手性添加劑，加入流動(dòng)相中，其分離機(jī)理與環(huán)糊精手性固定相相同，但保留行為正好相反。對(duì)映異構(gòu)體與環(huán)糊精形成的包合物穩(wěn)定性越強(qiáng)，隨流動(dòng)相出柱越快，保留時(shí)間越短。

　　(3)手性離于對(duì)添加劑

　　解離的有機(jī)化合物能與含互補(bǔ)電荷的試劑相互作用，生成電中性離子對(duì)。分離帶電荷的對(duì)映異構(gòu)體時(shí)，可以在流動(dòng)相中添加手性的離子對(duì)試劑，對(duì)映異構(gòu)體和離子對(duì)試劑形成電中性的離子對(duì)，離子對(duì)在固定相和流動(dòng)相間分配系數(shù)不同而得到分離。常用的手性離子對(duì)試劑有(+)10-樟腦磺酸、奎寧等。

　　二、高效液相色譜儀高效液相色譜儀主要由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)等組成。

　　(一)輸液泵

　　高效液相色譜的流動(dòng)相采用高壓泵輸送，有不同類型的輸液泵，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。目前使用較多的是柱塞式往復(fù)泵，柱塞式往復(fù)泵為恒流泵，可按設(shè)定的流速輸送流動(dòng)相，流量不受柱阻力的影響，可保持恒定，并容易清洗和更換。由于柱塞式往復(fù)泵是通過柱塞的往復(fù)運(yùn)動(dòng)來關(guān)液的，所以輸液的脈動(dòng)性較大。目前多采用雙泵補(bǔ)償?shù)姆椒�減小脈動(dòng)性。雙泵補(bǔ)償是同時(shí)使用兩個(gè)泵進(jìn)行工作，兩個(gè)泵可以按串聯(lián)或并聯(lián)方式連拉，交替送液，相互補(bǔ)償，達(dá)到減小脈動(dòng)的目的。

　　(二)進(jìn)樣器

　　進(jìn)樣器是將試樣送入色譜柱的裝置。一般要求進(jìn)樣裝置的密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。有進(jìn)樣閥和自動(dòng)進(jìn)樣裝置兩種。除使用自動(dòng)進(jìn)樣裝置外，用手工進(jìn)樣均使用六通進(jìn)樣閥。在工作狀態(tài)下，儀器系統(tǒng)內(nèi)處于高壓的狀態(tài)，借助于六通進(jìn)樣閥，實(shí)現(xiàn)了常壓下不停流進(jìn)樣。

　　六通進(jìn)樣閥可分為定子和轉(zhuǎn)子兩部分，共有6個(gè)口，故稱為六通進(jìn)樣閥。轉(zhuǎn)子通過扳手調(diào)節(jié)，可以分別處于“裝樣”和“進(jìn)樣”兩個(gè)位置。當(dāng)將扳手扳至“進(jìn)樣”位時(shí)，進(jìn)樣閥的流路發(fā)生了改變，流動(dòng)相通過樣品管，將注入的樣品帶入色譜柱進(jìn)行分析。六通進(jìn)樣閥具有使用方便，進(jìn)樣量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。樣品環(huán)有10μl、20μl、50μl等不同容積，可以選配。樣品環(huán)不僅可以用來貯液，也可用來測量樣品溶液的體積。將樣品環(huán)裝滿后，進(jìn)樣，進(jìn)樣量即為樣品環(huán)的容積，此種進(jìn)樣方式稱為“滿環(huán)進(jìn)樣”或“定量環(huán)進(jìn)樣”。用定量環(huán)進(jìn)樣精密度好，在使用外標(biāo)法時(shí)，應(yīng)使用此種操作方式。

　　(三)色譜柱色譜柱是色譜分離的核心。為了保證色譜柱的柱效高，使用壽命長，一般使用由專業(yè)化工廠生產(chǎn)的商品柱。色譜柱管多由不銹鋼制成，內(nèi)裝一定的固定相。色譜往長一般10～30cm，內(nèi)徑2～5mm。

　　化學(xué)鍵合相是廣泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷鍵合硅膠(octadecylsilylsilicagel，ODS)的應(yīng)用最為廣泛，ODS為非極性化學(xué)健合相，此外還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等，非極性化學(xué)健合相用于反相色譜法。中等極性的化學(xué)鍵合相有苯基化學(xué)鍵合相等，氰基化學(xué)鍵合相和氨基化學(xué)鍵合相是常用的極性化學(xué)鍵合相，極性的化學(xué)鍵合相一般用于正相色譜法。吸附色譜的固定相中使用最多的是硅膠。無論自己填裝的色譜柱還是購買的商品柱，使用能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下的柱壓、理論塔板高度和理論塔板數(shù)、對(duì)稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性等。

　　(四)檢測器樣品經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入檢側(cè)器進(jìn)行檢測。按其適用范圍檢測器可分為通用型和專屬型兩大類，專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì)，紫外檢測器(UVD)，熒光檢測器(ED)屬于這一類，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng);通用型檢測器檢測的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，示差折光檢測器(RID)，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)等。